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產品名稱:

豬圓環病毒熒光PCR試劑盒

產品型號: 產品時間: 2023-07-05
豬圓環病毒熒光PCR試劑盒的使用可很大限度的減少人為誤差,使用時只需加入DNA模板和引物既可,方便快捷,能避免PCR操作過程中的污染。具有具有高靈敏度、高特異性、高穩定性等特點。

產品概述

  豬圓環病毒熒光PCR試劑盒使用說明書
 
  【試劑盒簡介】
 
  豬圓環病毒熒光PCR試劑盒,采用聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測豬血清和組織中的PCV,適用于PCV的檢測、診斷和流行病學調查。
 
  【原理】
 
  提取DNA作為模板,在DNA聚合酶的作用下,經高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環,使特異DNA片段的拷貝數放大數百萬倍。將擴增的DNA片段進行電泳、染色后,在紫外燈下,肉眼可見DNA片段的擴增帶。
 
  【試劑盒組份】

1. 生理鹽水 20mL 8. 吸附柱和收集管 10套
2. 裂解液 6mL 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 15個
3. 洗滌液A 7mL 10. RT-PCR 反應液A 180μL
4. 洗滌液B 7mL 11. RT-PCR 反應液B 50μL
5. 洗脫液 500μL 12. 50 倍TAE 電泳緩沖液 20mL
6. 陰性對照 300μL 13. 染色液 10μL
7. 陽性對照 300μL    
 
 
  注:塑料袋內試劑(陽性對照、RT-PCR反應液A和B)-20 ℃凍存,裂解液2-8℃冷藏,其他室溫保存。
 
  【操作方法】
 
  一、樣品制備
 
  1樣品采集:病死或撲殺的豬,取肺、扁桃體和腦等組織;待檢活豬,用注射器取血5mL,2~8℃保存。(要求送檢病料新鮮,嚴禁反復凍融。)
 
  2樣品處理:
 
  2.1組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物;然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取100µL上清于1.5mL滅菌離心管中。
 
  2.2全血樣品的處理:待血凝后取100µL血清于1.5mL滅菌離心管中。
 
  2.3陽性對照的處理:取陽性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
 
  2.4陰性對照的處理:取陰性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
 
  二、病毒RNA的提取
 
  1.取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入450µL裂解液,充分顛倒混勻,室溫靜置3min。
 
  2.加入275µL無水乙醇,輕輕混勻。
 
  3.將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質,以免離心時堵塞吸附柱),10,000rpm離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
 
  4.向吸附柱中加入500µL洗滌液A,10,000rpm離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
 
  5.向吸附柱中加入500µL洗滌液B,10,000rpm離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
 
  6.空柱10,000rpm離心2min。
 
  7.將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5mL離心管中,在膜中央加入30µL洗脫液,室溫靜置2min,10,000rpm離心1min,獲得總RNA。
 
  三、RT-PCR
 
  1.反應體系:分別取14µLRT-PCR反應液A(用前混勻)、4µLRT-PCR反應液B(用前混勻)和2µL模板RNA,混勻。
 
  2.反應程序:在PCR儀上運行以下程序:42℃45min,94℃3min;94℃30s、53℃30s、72℃30s,35個循環;72℃延伸10min。
 
  四、電泳
 
  1.制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
 
  2.電泳:待膠凝固后,取5µLPCR擴增產物點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
 
  3.染色:取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL,加入10µL染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結果。
 
  【結果判斷】
 
  陽性對照出現494bp擴增帶,陰性對照無帶出現(引物帶除外)時,實驗結果成立。被檢樣品出現494bp擴增帶為豬藍耳病毒陽性,否則為陰性。
 
  【需用但未提供的材料】
 
  組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。
 
  【豬圓環病毒熒光PCR試劑盒注意事項】
 
  1.本試劑盒有效期為6個月,不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的組分不要混用。
 
  2.所有試劑應在規定的溫度儲存,使用時拿到室溫下,使用后立即放回。
 
  3.注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內試劑瞬離15s,使液體全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
 
  4.嚴格按試劑盒說明書操作可以獲得的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
 
  5.RNA提取過程中,應戴口罩、勤換手套,盡量縮短操作時間。
 
  6.所有接觸病料的物品均應合理處理,以免污染實驗室。
 
 

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